想說的話

自2010版藥典開始，每五年一次的藥典升級都對微生物檢驗(yàn)的要求上一個臺階，留在記憶里的2015版藥典升級前的那些日子仍舊歷歷在目，讓我們在2020版藥典升級前回顧一下2015版升級前的那些點(diǎn)滴，以準(zhǔn)備迎接即將到來的2020版。

【備注】

以下文章為2015年編寫，僅為了拋磚引玉。

1、自查2015版是否做到位做扎實(shí)；

2、其中有些應(yīng)對方法（該方法指的是管理和應(yīng)對策略）可對2020版的升級準(zhǔn)備有所啟發(fā)和借鑒。

ROUND 4

2015版中國藥典微生物項(xiàng)變化的應(yīng)對策略：

菌種

上一篇使用大篇幅說了培養(yǎng)基，也是真正揭開這次連載的一些實(shí)施細(xì)節(jié)，其實(shí)寫這個連載的目的是希望大家不要對藥典微生物項(xiàng)升級那么多內(nèi)容抓狂，而是真正靜下心來想想其背后的意義和對于我們今后的工作會帶來什么。原本是想將培養(yǎng)基和菌種一起寫的，寫到后來發(fā)現(xiàn)如果寫在一篇，確實(shí)有些內(nèi)容會講的不夠細(xì)，所以將培養(yǎng)基和菌種拆開了，這次我們就來談?wù)勎覀冾B皮的菌種君吧！

1、 檢驗(yàn)用菌種的選擇

在藥典第三次征訂意見稿《9203 藥品微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則》的“菌種”項(xiàng)下有這么一句話“藥品微生物檢驗(yàn)用的試驗(yàn)菌應(yīng)來自認(rèn)可的國內(nèi)或國外菌種保藏機(jī)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)菌株，或使用與標(biāo)準(zhǔn)菌株所有相關(guān)特性等效的可以溯源的商業(yè)派生菌株”。這句話寫明了中國藥典對檢驗(yàn)用菌種的挑選原則，感覺上可以使用CMCC（中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心）、ATCC（美國典型菌種保藏中心）、NCTC（英國典型菌種保藏中心）等等，近還有供應(yīng)商給我推薦CICC（中國工業(yè)微生物保藏中心）的菌種。但是我們作為遵循中國藥典的企業(yè)來說，中國藥典微生物限度及無菌檢查項(xiàng)下的菌種是明確寫明僅可使用CMCC的菌種，所以大家沒有必要去挑戰(zhàn)，如果你使用ATCC的菌種，檢查官到時(shí)候問你ATCC和CMCC的區(qū)別，我相信我們這種等級的肯定是說不清的，這個項(xiàng)目是中檢所在做的研究，所以我們不去做這樣的挑戰(zhàn)，乖乖的選擇符合我國國情的CMCC菌種即可，免去一系列無意義的解釋。

當(dāng)然有些企業(yè)的產(chǎn)品需要出口，要符合出口國的藥典標(biāo)準(zhǔn)，國外相對來說就放寬很多，但是也有一部分國家不太承認(rèn)我們的CMCC菌種。在我的工作經(jīng)歷中，發(fā)現(xiàn)國內(nèi)的審計(jì)官員對微生物方面了解的甚少，但是有次我們企業(yè)請了一名國外資深專家來我們公司全面審計(jì)的時(shí)候，他一看我們檢出的環(huán)境菌種就娓娓道來，讓我很吃驚，我不知道是不是國外對于微生物這塊的重視程度和我國還有一定差距還是什么，他們的藥典中對于檢驗(yàn)菌種的挑選也不止一種，認(rèn)可范圍更加寬泛。現(xiàn)在迎審過程中，我們微生物實(shí)驗(yàn)室更多的是解釋而非探討，我們也希望國內(nèi)的檢查團(tuán)隊(duì)中能多一些對微生物了解的老師來給我們幫助和指導(dǎo)。

2、 檢驗(yàn)用菌種的管理

我們實(shí)驗(yàn)室對于菌種的管理也歷經(jīng)了不少波折，現(xiàn)在的管理模式和使用下來的效果還是比較令人滿意的，菌種其實(shí)怕就是其活力消退或變異。有些外企的管理模式真的非常方便，使用定量菌株直接實(shí)驗(yàn)，可能現(xiàn)在還不太適用于我們大部分國內(nèi)企業(yè)，因?yàn)樗麄兪褂玫亩烤晔茿TCC等授權(quán)的國外企業(yè)制造并供貨的，特別是M家的產(chǎn)品，我就不多說了以免有廣告嫌疑，國內(nèi)應(yīng)運(yùn)而生的定量菌株我個人還是保留意見。出去培訓(xùn)時(shí)還是會發(fā)現(xiàn)有很多國內(nèi)企業(yè)對于菌種的管理方式特別是保藏方法存在一定問題，菌種死亡變異的事件還是時(shí)有發(fā)生。以下我就介紹下我們企業(yè)的菌種管理模式，并介紹2種比較方便的菌種保藏方法。

藥典的標(biāo)準(zhǔn)菌株大部分企業(yè)都會有以下七種：金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉，這些菌種我們是依據(jù)保藏的效期，在每年的年末購買一次，購買的是次年要過保藏效期的標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株。這里大家可能就會有疑問了，為什么我們只有標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株，那是因?yàn)槲覀冎毁徺ICMCC標(biāo)準(zhǔn)菌株，即0代菌株，僅保藏使用0代復(fù)蘇出來的1代標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株，使用的即是1代標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株復(fù)蘇的2代菌株，這樣避免活力及變異事件的發(fā)生，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室日常也沒有精力去處理這些事情，所以在10版藥典的時(shí)候，我們就把管理模式重新調(diào)整了一下，整個流程為菌株申購→菌株驗(yàn)收→菌株確認(rèn)→菌株保藏→菌株領(lǐng)用→菌株使用→菌株銷毀。

1） 菌株申購

購買檢驗(yàn)用菌株，必須由檢驗(yàn)用菌株的管理人員提出申請、陽性室負(fù)責(zé)人審核、部門經(jīng)理批準(zhǔn)后方可進(jìn)行購買，公司的采購人員必須憑著被簽批的單子才能夠進(jìn)行菌種的購買，因?yàn)檫@畢竟關(guān)系到生物安全問題，所以申購必須慎重。

2） 菌株驗(yàn)收

每支過來的0代安瓿必須經(jīng)過確認(rèn)，實(shí)驗(yàn)室至少要進(jìn)行菌落形態(tài)和革蘭氏染色的實(shí)驗(yàn)，有條件的話通過生化或其他方法確認(rèn)到屬種。該實(shí)驗(yàn)是確認(rèn)菌株的純度、活力和特性，我們是確認(rèn)復(fù)蘇后的1代標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株，即我們保藏的菌株，保證保藏的菌株的質(zhì)量。

3） 菌株保藏

其實(shí)在確認(rèn)同時(shí)我們即進(jìn)行了保藏，若確認(rèn)不合格，則銷毀該批次保藏批的菌株，我們實(shí)驗(yàn)室的保藏方法很簡單，也是借鑒08-09年我的領(lǐng)導(dǎo)去中檢所培訓(xùn)帶回來的保藏方法，即使用液體培養(yǎng)基復(fù)蘇菌液，然后加入等量的20%甘油，制成含10%甘油的菌懸液，然后分裝至1ml/支，可以保存2年，但是黑曲霉我們是保藏孢子懸液，貯存于-15℃以下，有效期是1年。

現(xiàn)在也有很多實(shí)驗(yàn)室使用磁珠法保藏也是覺得效果不錯，其保藏后貯存在2-8℃，效期1年。

兩個方法各有利弊，甘油冷凍法每次實(shí)驗(yàn)使用一支，不會重復(fù)使用，避免重復(fù)凍融對菌株的挑戰(zhàn)以及重復(fù)開管引入的污染；但是磁珠法因?yàn)槭呛脦最w磁珠放在一管保存液里，每次使用會從該管里夾取一粒復(fù)蘇，可能重復(fù)操作引入污染，但是其優(yōu)勢在于對冰箱溫度要求不高，一般實(shí)驗(yàn)室都有滿足2-8℃的冰箱，而甘油冷凍管需要冷凍室進(jìn)行保存，所以對沒有—15℃以下溫度保證的實(shí)驗(yàn)室來說，還需購買相應(yīng)設(shè)備，這個就是各自實(shí)驗(yàn)室去評估選擇了。

這里我還是不太建議使用斜面，一兩個月就要轉(zhuǎn)一次，日常事情較多且對于菌株的確認(rèn)其實(shí)在傳代過程中也需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)確認(rèn)，這樣又帶來附加實(shí)驗(yàn)，一支買來的商業(yè)派生菌株（一般在省所買來的少也是2代了，基本都會是3代這種）管不了太久又需要買了，本來很多微生物實(shí)驗(yàn)室人手就不夠，轉(zhuǎn)種的多還要多配培養(yǎng)基，沒必要把精力放在這些事情上，如果實(shí)驗(yàn)室沒有冷凍冰箱，那可以考慮磁珠法，有的話可以考慮甘油冷凍法，這樣可以把工作菌株的使用有效期延長到1-2年。

還有要提一下保藏培養(yǎng)基的問題，之前金葡、大腸、枯草、銅綠都是使用營養(yǎng)肉湯，生孢使用硫乙醇，白念使用馬丁，黑曲霉使用TSA進(jìn)行復(fù)蘇，15版使用TSB、SDB、SDA了，我暫時(shí)不考慮更換細(xì)菌培養(yǎng)基，因?yàn)楫吘故褂媚敲炊嗄瓯２匦Ч容^理想，而且TSB有糖的問題，不過我還是覺得營養(yǎng)肉湯早晚會退出歷史舞臺，與其等到那時(shí)候束手無策，畢竟菌株保藏都是以年來計(jì)算的，到時(shí)候沒得賣就完蛋了，還不如把事情做在前面，在保證菌株儲備齊全的情況下，同步要挑戰(zhàn)使用TSB保藏金葡、大腸、枯草、銅綠的實(shí)驗(yàn)（至少1年），生孢依舊硫乙醇，白念使用SDB，黑曲霉使用SDA。還有使用新的培養(yǎng)基復(fù)蘇的菌濃問題，基本都比老的長的好，各個實(shí)驗(yàn)室可以先行試一下。

4） 菌株領(lǐng)用

我們保藏菌株的冰箱是雙人雙鎖，2 把鎖分別在陽性實(shí)驗(yàn)人員及陽性室負(fù)責(zé)人手上，日常取用菌株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)必須2人到場開冰箱取菌株，并在菌株領(lǐng)用臺賬上說明領(lǐng)用日期、原因、領(lǐng)用人等信息，保證菌株的流通可控。

5） 菌株使用

說到菌株使用我覺得我還是有些實(shí)驗(yàn)潔癖的，很多實(shí)驗(yàn)室是在生物安全柜內(nèi)幾個菌一起做，比如今天有3個菌的實(shí)驗(yàn)，都會安排在一起做。但是在我們實(shí)驗(yàn)室，我是嚴(yán)格要求在A菌和B菌之間必須清場，A菌實(shí)驗(yàn)使用的稀釋液、槍頭盒等必須撤離現(xiàn)場，消毒安全柜后開紫外燈30min以上，才可進(jìn)行B菌株實(shí)驗(yàn)，并且B菌實(shí)驗(yàn)使用的肯定不能是A菌實(shí)驗(yàn)使用余下的那些稀釋液和槍頭。因?yàn)閷?shí)驗(yàn)時(shí)產(chǎn)生的氣溶膠是我們?nèi)庋劭床灰姷?，雖然在混勻菌液時(shí)候我們是蓋緊試管蓋的，但是在打開蓋時(shí)我無法判斷是否有帶菌氣溶膠跑到空氣中沾到哪里，我承認(rèn)只要是無菌操作過關(guān)是不會交叉污染的，但是我不敢冒這個險(xiǎn)，還是老老實(shí)實(shí)遵循著避免交叉污染的宗旨，就和生產(chǎn)清場的概念一樣。

還要提一下黑曲霉，其實(shí)國內(nèi)有很多廠家還沒有購買黑曲霉，當(dāng)時(shí)他們問我的時(shí)候，我真的很奇怪他們怎么通過新版GMP審核的，這個暫且不論，反正我們實(shí)驗(yàn)對黑曲霉的處理倒是挺順利的，當(dāng)時(shí)10版藥典和中檢所SOP上都寫著用棉花放在管口防止孢子飛出什么的，我嫌麻煩，于是想了個法子，我們的試管是用膠質(zhì)的試管塞的，斜面上黑曲霉長好后，用一次性注射器吸取稀釋液從試管塞與試管的縫隙中插進(jìn)去，因?yàn)樵嚬苋怯袕椥缘?，那么?xì)的針頭是肯定能從其邊緣插進(jìn)去的，記得塞子始終保持緊閉，然后將液體打入管內(nèi)直至覆蓋所有黑曲霉生長的范圍，然后微微震蕩將孢子洗脫出來，洗脫后，將塞子打開（因?yàn)樗芯w均以被液體覆蓋故孢子飛散可能性降低很多）使用槍頭或移液管吸取孢子懸液進(jìn)行稀釋即可，當(dāng)然取原液時(shí)候的動作應(yīng)快速，減少其氣溶膠與空氣的接觸時(shí)間，至少我們實(shí)驗(yàn)室沒有發(fā)生過一次污染，而且黑曲霉的實(shí)驗(yàn)接入量控制的也很穩(wěn)定。

對于菌株梯度稀釋定量的問題，這里我就不多說了，這個只有多加練習(xí)了，而且每個人的梯度確實(shí)會有偏差，我們實(shí)驗(yàn)室是定好復(fù)蘇后的培養(yǎng)時(shí)間，比如金葡培養(yǎng)24h，那以后每次都是這個時(shí)間，這樣的菌濃一般都差不多，比較好控制，這個就是勤練！當(dāng)然你的計(jì)數(shù)培養(yǎng)基必須質(zhì)量穩(wěn)定，否則到時(shí)候因?yàn)橛?jì)數(shù)培養(yǎng)基的質(zhì)量問題而導(dǎo)致你一直認(rèn)為自己稀釋的功夫不到家就沒話說了。我們實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)都是當(dāng)天直接稀釋并接種的，菌量的成功率還是很高的，當(dāng)然實(shí)驗(yàn)人員都是下了一定功夫的，特別是那個比較無語的50-100cfu。

黑曲霉的孢子懸液、枯草的芽孢懸液和生孢的芽孢懸液都是可以經(jīng)過驗(yàn)證增加貯存時(shí)間的，具體的方法可以去網(wǎng)上查文獻(xiàn)，我覺得這個還是很有用的，使用起來很方便，關(guān)鍵減少工作量?。?！加個方法驗(yàn)證即可，惡心小段時(shí)間，舒服大段時(shí)間！

6） 菌株銷毀

這里的菌株除了保藏的標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株外，還有使用該菌株復(fù)蘇出的菌液、梯度稀釋的菌懸液以及菌株計(jì)數(shù)平皿，這些銷毀都是要記錄在案的，這個就是整個的流通過程，菌株的銷毀也是要經(jīng)過陽性室負(fù)責(zé)人批準(zhǔn)后執(zhí)行，并且銷毀后還需要陽性室負(fù)責(zé)人復(fù)核確認(rèn)。

3、 菌種實(shí)驗(yàn)室（生物安全實(shí)驗(yàn)室）的認(rèn)證及安全管理

在新版GMP中對于陽性對照室有明確的規(guī)定，必須符合P2生物實(shí)驗(yàn)室級別，現(xiàn)在還是有很多藥企的微生物實(shí)驗(yàn)室對P2這個概念有點(diǎn)模糊，這里解釋一下，P2實(shí)驗(yàn)室即二級生物安全實(shí)驗(yàn)室，相當(dāng)于BSL-2級病原微生物實(shí)驗(yàn)室，該級別實(shí)驗(yàn)室主要用于初級衛(wèi)生服務(wù)、診斷和研究，其實(shí)驗(yàn)對象的危害等級為Ⅱ級（中等個體危害，有限群體危害），具體定義為“能引起人類或動物發(fā)病，但一般情況下對健康工作者、群體、家畜或環(huán)境不會引起嚴(yán)重危害的病源體。實(shí)驗(yàn)室感染不導(dǎo)致嚴(yán)重疾病，具備有效治療和 預(yù)防措施，并且傳播風(fēng)險(xiǎn)有限”。這類的實(shí)驗(yàn)室就是P2級的實(shí)驗(yàn)室。其實(shí)大家日常并不陌生，只是看到了沒注意而已，在各大醫(yī)院都是有生物安全實(shí)驗(yàn)室的，只要是黃色醒目的標(biāo)牌上面有生物安全標(biāo)示（生化危機(jī)里的那個），上面寫著無關(guān)人員不得入內(nèi)等，那就是生物安全實(shí)驗(yàn)室了。

剛剛提到了P2實(shí)驗(yàn)室相當(dāng)于就是BSL-2級病原微生物實(shí)驗(yàn)室，那我們的陽性室基本上應(yīng)該都是要符合BSL-2級病原微生物實(shí)驗(yàn)室的，BSL-2級病原微生物實(shí)驗(yàn)室是可以在各省市或區(qū)縣的進(jìn)行認(rèn)證備案的，那也就是說如果檢查官問你，請問你們實(shí)驗(yàn)室是否符合P2實(shí)驗(yàn)室的生物安全要求，那你不用多做解釋，只需將BSL-2級病原微生物實(shí)驗(yàn)室的備案證書給他就可以了，在前面列舉的那些如銅綠假單胞菌、白色念珠菌均屬于BSL-2級病原微生物，這個備案也需要一定過程，的老師會根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)室布局提出自己的意見，我們實(shí)驗(yàn)室是經(jīng)過設(shè)施改造后終達(dá)標(biāo)的，每年均會進(jìn)行一次突擊的飛行檢查（不會提前一天，比如9點(diǎn)打電話10點(diǎn)就到現(xiàn)場了），我個人覺得管理力度還是非常夠的，能很好的督促我們嚴(yán)格的管理我們的生物安全實(shí)驗(yàn)室。

那對于使用菌株的生物安全實(shí)驗(yàn)室，安全問題非常非常的重要，菌株的無故外泄、人員實(shí)驗(yàn)室的溢撒事件等等都是一系列需要關(guān)注的問題。我們在陽性室設(shè)置門禁，避免無關(guān)人員進(jìn)入；在設(shè)備方面我們盡量做到陽性室，如菌株保藏冰箱、菌株培養(yǎng)箱、菌株滅菌器，這些全部設(shè)置在生物安全實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部；對于生物安全的管理設(shè)有專門的生物安全委員會，有處理各種生物安全事件的應(yīng)急預(yù)案，每年都會進(jìn)行應(yīng)急演練并拍照和錄像，每年會對整個生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行整體評估出具評估報(bào)告，并且每年對生物安全實(shí)驗(yàn)室的人員進(jìn)行生物安全培訓(xùn)，讓每一位參與菌株實(shí)驗(yàn)的人員都明白其中的重要性。

菌株的事情可大可小，我們在認(rèn)識這種活體小東西的同時(shí)必須盡可能的了解它們的特性，讓它們?yōu)槲覀兯?，并盡量避免安全事故的發(fā)生（SARS就是從實(shí)驗(yàn)室出去的。。。），所以我們必須特別小心謹(jǐn)慎的操作它們，重要的還是這點(diǎn)——保護(hù)好自己！

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